Laboratorio Biogen, I servizi - Analisi del DNA e medicina predittiva

I NOSTRI SERVIZI

Analisi del DNA e medicina predittiva: i metodi
L’analisi cromosomica
Grazie all’ibridazione in situ, una tecnica che deriva dai progressi della citogenetica e della biologia molecolare, è ormai possibile analizzare con grande precisione le anomalie cromosomiche come le mutazioni, le delezioni, ecc.

L’analisi dei geni
Sono possibili due tipi di percorso: lo studio dell’espressione fenotipica dei geni analizzati, o l’analisi genomica del gene responsabile. Nel primo caso, l’analisi del fenotipo può essere realizzata sia direttamente sul prodotto dell’espressione del gene, come nel caso delle malattie congenite del metabolismo o per gli antigeni di istocompatibilità (HLA), sia indirettamente attraverso l’analisi delle modificazioni metaboliche specifiche della malattia, come nel caso della fenilchetonuria. Per le malattie dovute alla sintesi di proteine disfunzionali come la miopatia - dovuta all’alterazione della distrofina - è ormai più facile e più efficace, grazie alle nuove tecniche, analizzare direttamente la proteina in causa (test biochimici), piuttosto che il DNA.

Nel secondo caso se si conosce il gene responsabile e la sua posizione nella sequenza del DNA.

L’analisi del DNA
Grazie a tecniche facilmente automatizzabili come la PCR (Polymerase Chain Reaction), è oggi possibile localizzare, isolare e caratterizzare il gene per poi identificare le proteine responsabili della maggior parte delle grandi malattie monogeniche, cioè dovute a un solo gene. La diagnosi si effettua con tecniche di ibridazione per mezzo di sonde molecolari specifiche. Purtroppo, per la maggior parte delle malattie monogeniche il numero di mutazioni possibili e responsabili della patologia è troppo elevato, e la loro caratterizzazione per ogni singola famiglia non è raccomandabile nella pratica. La scoperta di sequenze del DNA molto polimorfe tra un individuo e l’altro, i microsatelliti, consente, quando queste accompagnano sistematicamente, all’interno della stessa famiglia, un gene mutato, di seguire la trasmissione del gene in seno alla famiglia stessa. Questi microsatelliti, ripartiti in tutto il genoma, possono consentire un’identificazione degli individui tramite “impronte genetiche”, che possono servire da base alla definizione di carte di identità genetiche che consentono la perfetta distinzione tra un individuo e l’altro, senza necessariamente fornire indicazioni sulle loro caratteristiche genetiche, come per esempio la predisposizione a certe malattie.

L’ibridazione molecolare
Dopo isolamento a partire dai linfociti del sangue o anche da altre cellule dell’organismo, seguita da purificazione, il DNA a doppio filamento subisce una denaturazione che conduce alla formazione di un DNA a filamento singolo. Il DNA così ottenuto viene depositato su un supporto e messo in presenza di una sonda, frammento di DNA complementare della zona da ispezionare, talvolta radioattivamente marcato. Se la sequenza ricercata, quella che contiene la mutazione, è presente nel DNA analizzato, la sonda le si accoppierà. Il riconoscimento del frammento difettoso da parte della sonda è facilmente visibile grazie a una autoradiografia, una tecnica che permettere di rilevare la radioattività su pellicola fotografica. Se il riconoscimento non ha luogo, l’autoradiografia è negativa. Si possono impiegare due tipi specifici di ibridazione: l’ibridazione in situ, che consente il rilevamento della zona che contiene la mutazione, direttamente sul cromosoma; e il Southern blot, che unisce la tecnica classica di ibridazione a una tecnica elettroforetica (migrazione del DNA elettricamente caricato in un campo elettrico). In questo caso, i frammenti di DNA formati dall’azione di enzimi specifici, vengono separati in funzione della loro dimensione.

La PCR, Polymerase Chain Reaction
La PCR, o reazione di polimerizzazione a catena, è una tecnica relativamente recente, inventata nel 1983 da Kary Mullis. Essa consente di amplificare selettivamente una sequenza di DNA. Grazie a questa tecnica, la biologia molecolare ha compiuto in 10 anni dei progressi senza precedenti. Il principio della PCR consiste nel copiare un frammento di materiale genetico, (DNA o RNA) in molti milioni di esemplari. A partire da una sola sequenza-bersaglio di DNA, la tecnica PCR produce in meno di tre ore 100 milioni di copie. E’ facile comprendere l’interesse di questa tecnica nel campo della biologia molecolare quando si intenda identificare una sequenza precisa di DNA, modificarla o ricercare una mutazione, poiché diventa possibile operare su una enorme quantità di materiale. Grazie a questa tecnica, correntemente utilizzata in tutti i laboratori di ricerca, è stato possibile portare a termine il progetto di decodificazione completa del genoma umano.

LABORATORIO BIOGEN
Laboratorio di Genetica e Biologia Molecolare
direttore d.ssa Sebastiana Pappalardo

Indirizzo: via Eroi di Rodi, 214 - 00128 Roma
Telefono/Fax: 06 - 5082068
Telefono: 06 - 5083375
E-mail: info@laboratoriobiogen.it
Pagina aggiornata al 14/01/2008

Il DNA
Il DNA, o acido desossiribonucleico, è presente nelle cellule in una struttura a doppia elica in cui le spirali sono intrecciate tra di loro continuamente senza mai allontanarsi o avvicinarsi l’una all’altra. L’unità di base del DNA è rappresentata dal nucleotide, che è costituito da una base, uno zucchero e un atomo di fosforo. In una sequenza di DNA sono contenuti solo quattro nucleotidi diversi, l’adenina, la citosina, la guanina e la timina, che normalmente si rappresentano con la loro iniziale A, C, G e T. Il nostro patrimonio genetico ne contiene circa 6 miliardi, in tutte le combinazioni possibili – e sono proprio queste a renderci unici, cioè diversi l’uno dall’altro. Nella struttura a doppia elica del DNA i nucleotidi sono presenti in coppie appaiate frontalmente, e il loro accoppiamento segue sempre queste regole:
ci sono solo quattro tipi possibili di nucleotide: A, C, G e T

A e T possono accoppiarsi solo tra di loro
G e C possono accoppiarsi solo tra di loro
T e C non possono accoppiarsi tra di loro
A e G non possono accoppiarsi tra di loro

La sequenza continua dei nucleotidi e il modo in cui la sequenza ha luogo determinano le caratteristiche strutturali, fisiche e anatomiche di un organismo. Il DNA codifica la vita, ma in che modo? Il DNA dice al corpo quali proteine produrre, ma come fa a codificarle, e di cosa sono fatte le proteine? Le proteine sono composte di aminoacidi, legati insieme in catene durante un processo noto come trascrizione. Per stabilire quali aminoacidi devono essere legati, alcuni enzimi devono essere capaci di “leggere” i segmenti di DNA, costruire i segmenti di RNA (acido ribonucleico) complementari a quelli del DNA, e infine mettere insieme la catena di aminoacidi.

La replicazione del DNA
La maggior parte delle cellule non vive per sempre e proprio per questo deve trasmettere le proprie informazioni alle nuove cellule; per farlo, deve essere in grado di replicare (copiare) il DNA che contiene per trasmetterlo alla propria discendenza. Inoltre i frammenti di DNA (i geni) devono venire replicati perché codifichino per particolari funzioni corporee necessarie per la sopravvivenza. E’ indispensabile che la replicazione sia esatta, e perché ciò avvenga devono essere disponibili:

» il DNA esistente, che agisce come la matrice originale
» un insieme di nucleotidi appropriati e liberamente fluttuanti
» una scorta di enzimi idonei a stimolare la reazione
» l’ATP, o adenosina trifosfato, che fornisce l’energia per la reazione

Durante la replicazione la struttura a doppia elica si srotola, rendendo esposto ogni singolo segmento di DNA; quando si srotolano, i nucleotidi in sequenza vengono esposti, e i nucleotidi liberamente fluttuanti si possono accoppiare con loro secondo la regola strettissima che già conosciamo. Dopo l’”accoppiamento”, tutti i nucleotidi si ri-arrotolano e ricostituiscono la doppia elica, e poiché nella replicazione sono coinvolti due segmenti di DNA, la prima doppia elica risultante dalla replicazione produrrà due copie di se stessa per ciascun segmento. Il DNA replicato è considerato semi-conservativo perché possiede il 50% del materiale genetico originale, cioè è formato dal DNA originale + il DNA replicato. Le due nuove copie hanno lo stesso DNA contenuto nella prima. Questa particolare caratteristica consente la trasmissione dell’informazione genetica da una cellula all’altra, e dai genitori alla loro discendenza. In termini ancora più semplici, potremmo dire che poiché nella replicazione solo la timina e l’adenina, e solo la guanina e la citosina possono rispettivamente accoppiarsi tra di loro, ciascuna delle due nuove copie di DNA è formata al 50% dal materiale originale, e al 50% da quello replicato. Poiché la replicazione del DNA avviene su 6.000.000.000 di basi per innumerevoli accoppiamenti, la probabilità che in due organismi distinti la sequenza degli accoppiamenti si verifichi in modo identico è infinitamente piccola sotto il profilo statistico, perciò si ritiene che a eccezione dei gemelli monovulari o monozigoti, non esistono due organismi con lo stesso identico DNA.